Методы, основанные на связывании меченых антигенов и антител

(3 Голосов)
Рейтинг пользователей: / 3
ХудшийЛучший 

Эти методы высокочувствительны. В качестве метки применяют флюоресцентные красители, радиоактивные изотопы, ферменты и др.

Иммунофлюоресцентные методы.Прямой метод иммунофлюоресценции (по Кунсу) основан на взаимодействии антител, меченых флюорохромом, с антигеном, который находится на клетке, в клетке или в тканях. В качестве флюорохрома используют флюоресцеинизотиоционат (ФИТЦ). Он дает зеленое свечение в ультрафиолетовых лучах, а тетраметилродаминизотиоцианат (ТРИТЦ) -оранжево-красное свечение. Прямой метод одноэтапный: на фиксированный мазок клеток с антигеном наносят диагностическую сыворотку с антителами, мечеными ФИТЦ, инкубируют, отмывают и, при положительном результате, учитывают свечение в люминесцентном микроскопе.

Непрямой метод иммунофлюоресценции заключается в том, что первоначально антиген обрабатывают обычной диагностической сывороткой, которую получают путем иммунизации кроликов соответствующим антигеном. Для обнаружения образовавшегося комплекса антиген-антитело используют антисыворотку, меченую флюорохромом против иммуноглобулинов кролика. Такую сыворотку получают путем иммунизации барана иммуноглобулинами кролика. Непрямой метод дает возможность обнаруживать различные комплексы антиген-антитело с помощью одной меченой антиглобулиновой сыворотки.

Метод иммунной флюоресценции применяют для идентификации бактерий, риккетсий, вирусов, а также для определения рецепторов и антигенов животных клеток человека и животных.

Иммуноферментный анализ. В методах иммуноферментного анализа (ИФА) используют иммунореагенты, меченные ферментами. Наиболее широко применяется твердофазный ИФА. В качестве твердой фазы чаще всего используют полистироловые или поливиниловые планшеты или шарики, на которых адсорбированы антигены или антитела.

Для выявления антител известный антиген адсорбируют в лунках полистирбловой пластины. Затем вносят исследуемую сыворотку, в которой хотят обнаружить антитела к данному антигену. После инкубации лунки промывают для удаления несвязавшихся белков и вносят в них антииммуноглобулиновые антитела, меченные ферментом (обычно пероксидазой). После инкубации и отмывания в лунки добавляют специфичный для фермента субстрат (перекись водорода) и хромоген (орто-фенилендиамин) для регистрации конечных продуктов расщепления субстрата. О наличии и количестве антител судят по изменению цвета и интенсивности окраски раствора.

Методы ИФА обладают высокой чувствительностью и специфичностью и получили широкое распространение в различных областях биологии и медицины. В клинической диагностике с помощью фиксированных на твердой фазе антител, в том числе моноклональных, определяют концентрации лекарственных препаратов в организме, присутствие антигенов раковых клеток, микроорганизмов и т. д. Используя твердофазные носители с антигенами выявляют антитела к различным видам бактерий, вирусов, простейших. Так, планшеты с адсорбированными антигенами вируса иммунодефицита человека служат для диагностики ВИЧ-инфекции.

Радиоиммунологический анализ. Принцип радиоиммунолсгического анализа (РИА) основан на выявлении комплекса АГ-АТ, в котором один из иммунореагентов был мечен радиоактивным изотопом. Обычно используют изотопы йода (1251 или 1311). Учет реакции проводят по убыванию или по возрастанию радиоактивности (в зависимости от методики РИА) с помощью специальных счетчиков b или у-излучения. Метод высокочувствителен, но постепенно вытесняется иммуноферментным анализом, учитывая небезопасность работы с радиоактивными изотопами и необходимость в сложном регистрирующем оборудовании.